OPTIMASI FASE GERAK

OPTIMASI FASE GERAK

Pemilihan fase gerak untuk pemisahan campuran sederhana mungkin bukanlah masalah yang sangat sulit dan dapat dilakukan dengan cepat secara trial and eror. Sistem pelarut dapat diskrining secara paralal dengan menggunakan beberapa bilik pengembangan atau perangkat seperti bilkik Castro Vario KS, yang memungkinkan evaluasi dari sejumlah pelarut secara simultan yang memungkinkan masing-masing skrining ini untuk berpindah menyusuri saluran paralel yang diukur pada pelat KLT tunggal. Namun, setiap kali jumlah komponen dalam campuran bertambah tetapi kapasitas tempat sistem KLT hanya untuk sebagian kecil fraksi dari, maka diperlukan sebuah metode optimalisasi yang lebih sistematik.

Karena kesamaan mekanisme retensi maka hampir tidak mengejutkan bahwa metode utama pemilihan pelarut dalam KLT adalah identik dengan yang digunakan pada kromatografi kolom cair. Karena larutan yang digunakan dalam separasi diuapkan sebelum deteksi, berbagai pelarut absorbansi UV biasanya digunakan dalam KLT daripada dalam kasus HPLC. Pelarut harus sangat murni,  karena kotoran yang tidak mudah menguap tetap diserap ke layar yang menyebabkan kemiringan dan ketidakstabilan garis pada densitometri  (19,159). Stabiliser dan antioksidan yang biasanya ditambahkan ke beberapa jenis pelarut (misalnya Eter, tetrahidrofuran, dioksan) adalah masalah yang paling sering. Perbedaan yang paling signifikan antara metode kromatografi kolom dan cair berhubungan dengan kondisi non-ekuilibrium yang terjadi selama pemisahan oleh KLT. Dalam KLT, fase gerak terpapar dengan lapisan kering yang secara selektif mengadsorbsi pelarut dengan afinitas paling tinggi, memangkas fase gerak dari komponen ini dan menghasilkan kemiringan pelarut kearah perkembangan (lihat bagian 7.2.1 untuk lebih rinci). Pemisahan seperti namanya, mungkin terjadi utuh, menghasilkan pembentukan zona dengan tepi yang tajam yang memisahkan menjadi bagian-bagian dari komposisi pelarut yang berbeda dan, oleh karena itu, disebut selektivitas. Pertimbangan ini menghambat strategi optimasi berdasarkan komposisi pelarut yang ditambahkan ke bilik pengembangan.

Pelarut yang digunakan dalam kromatografi cair dicirikan oleh kekuatan dan selektivitasnya berdasarkan skema percobaan seperti yang diusulkan oleh Snyder. Dengan demikian pelarut dapat diberikan kepada salah satu dari beberapa kelompok selektivitas berdasarkan karakteristik interaksi intermolekular dan bertingkat dalam hal kemampuan mereka untuk bersaing memindahkan berbagai jenis sampel dalam sistem kromatografi, yang dijelaskan oleh parameter kekuatan pelarut (lihat bagian 4.6 untuk lebih rinci). Dalam KLT, pelarut dengan kekuatan yang benar untuk berkembang secara unidimensi akan memindahkan sampel ke rentang nilai R1 0,2-0,6. atau sekitarnya, dan jika dengan selektivitas yang benar, akan mendistribusikan sampel secara merata di seluruh rentang nilai ini, atau memenuhi beberapa kriteria resolusi lainnya ditetapkan untuk pemisahan tertentu. Pelarut dari kekuatan yang sama tetapi selektivitasnya berbeda, dipreparasi dengan memilih pelarut dari kelompok selektifitas yang yang berbeda dan mengencerkannya menjadi volume fraksi yang tepat dengan pelarut yang lemah menurut karakteristik parameter kekuatan pelarutnya, seperti yang dijelaskan untuk kromatografi kolom cair (bagian 4.6). Pencampuran lebih lanjut dari pelarut ini akan menghasilkan campuran pelarut terner dan quaterner dengan kekuatan yang sama akan memberikan kemudahan atas selektivitas. Penggunaan prosedur trial and eror ini diulas di tempat lain (8, 112), dan secara ringkas akan kami lihat salah satu model ini, model PRISMA, dalam beberapa ulasan, sebagai contoh dari pendekatan yang sering digunakan dalam KLT. Strategi komputerisai untuk optimasi fase gerak KLT menggunakan jendela diagram (142,160). Membuat peta resolusi (161.162), metode simpleks (9,163-165], dan prosedur pengenalan komputer (166,167) telah jarang digunakan dalam KLT dibandingkan dengan HPLC. Dalam prosedur ini beberapa bentuk desain statistik digunakan untuk memilih sekelompok pelarut untuk evaluasi, atau alternatif, hasil yang diperoleh dari selektifitas serangkaian pelarut dibandingkan untuk menunjukkan pemisahan yang diperoleh. Perbandingan dibuat berdasarkan pada seleksi fungsi matematika untuk menentukan kualitas spemisahan dengan indeks numerik, atau teknik, misalnya pemetaan resolusi, yang digunakan untuk evaluasi visual. Untuk menggunakan metode secara efektif sejumlah besar titik data (Komposisi fase gerak) diperlukan dan pemilihan fungsi pemisahan dapat menyebabkan prediksi fase gerak optimum yang berbeda yang mungkin membingungkan. Namun, untuk optimasi campuran kompleks pendekatan tersebut tampaknya dibenarkan, dan cenderung lebih bermanfaat daripada prosedur trial and error yang lebih sering dipakai. Sebelum metode tersebut digunakan secara lebih luas
maka perlu menunjukkan kegunaannya dalam KLT, dan untuk menyediakan tingkat standarisasi yang lebih besar untuk aplikasi rutin.

Perbedaan penting antara teknik desain statistik campuran yang populer dalam HPLC dan model PRISMA adalah bahwa yang pertama menghasilkan komposisi pelarut yang dihitung secara optimal sedangkan yang kedua bergantung pada pendekatan trial dan eror terstruktur, yang sudah diadaptasi dalam KLT. Perubahan pelarut dan ekualibrasi dalam HPLC dapat memakan waktu yang agak lama, sehingga perlu diperhatikan agar meminimalkan jumlah percobaan, sedangkan pada KLT, percobaan dapat dilakukan secara paralel dan kendala waktu kurang signifikan. Perubahan kekuatan pelarut juga lebih cepat disesuaikan secara empiris dalam Model PRISMA ketika pertimbangan teoritis tidak memadai atau memerlukan modifikasi yang karena perbedaan pendekatan percobaan.

Model PRISMA dikembangkan oleh Nyiredy untuk optimasi pelarut dalam KLT dan HPLC (142,168-171). Model PRISMA terdiri dari tiga bagian; seleksi sistem kromatografi, optimasi fase gerak tertentu, dan pemilihan metode pengembangan. Karena silika adalah fase diam yang paling digunakan dalam KLT, prosedur optimasi selalu dimulai dengan tahap ini, meskipun metode ini berlaku untuk semua fase terikat secara kimia dalam mode normal atau fase terbalik. Untuk pemilihan pelarut yang cocok, percobaan pertama yang dilakukan pada pelat KLT dalam bilik yang tidak jenuh dengan 10 pelarut, dipilih dari kelompok selektifitas Snyder yang berbeda kelompok, dan digarisbawahi dalam Tabel 7.8 (171). Setelah percobaan KLT pertama ini dengan pelarut tunggal, kekuatan pelarut turun atau naik zona senyawa didistribusikan di rentang nilai R1 0,2-0,8. Jika senyawa berpindah ke atas ke pelat ketiga, kekuatan pelarut harus dikurangi dengan dilusi menggunakan hexana, penyesuaian kekuatan pelarut (kekuatan pelarut - 0). Jika senyawa tetap dalam pelat ketiga terbawah dengan pelarut tunggal, kekuatan pelarutnya harus ditingkatkan dengan penambahan air atau asam asetat. Prosedur yang sama dilakukan dalam modus fase terbalik kecuali seleksi pelarut tersebut terbatas pada pelarut air, faktor-faktor bobot pelarut empiris digunakan dalam nilai Snyder, dan air digunakan sebagai penyesuai kekuatan pelarut (kekuatan pelarut - 0). Pelarut selain pelarut tersebut, diindikasikan sebagai pelarut yang disukai dapat diuji pada titik ini untuk mendapatkan pemisahan yang terbaik. Dari percobaan ini, pelarut yang menunjukkan pemisahan yang terbaik dipilih untuk optimasi lebih lanjut di bagian kedua dari model ini. Jika diantisipasi bahwa pengembangan aliran yang dipaksa akan digunakan untuk pemisahan jadi lebih menguntungkan untuk memasukkan satu pelarut dalam kombinasi pelarut yang dipilih jika sampel tidak bermigrasi (l69). Pelarut ini dapat digunakan dalam pra-uji untuk menghilangkan zona pengganggu yang disebabkan oleh gas yang tidak larut dalam Layer tertutup, yang memiliki efek merugikan pada pemisahan.

Antara dua dan lima pelarut dapat dipilih untuk pengembangan model PRISMA. Pemodifikasi seperti asam, reagen ion berpasangan, dll dapat ditambahkan untuk meningkatkan pemisahan dan mengurangi tailing. Pemodifikasi umumnya digunakan dalam konsentrasi rendah dan konstan sehingga pengaruh mereka terhadap kekuatan pelarut dapat diabaikan. Model PRISMA yang sebenarnya, Gambar 7.14, desain geometris tiga dimensi yang menghubungkan kekuatan pelarut dengan selektivitas fase gerak (170) Model ini terdiri dari tiga bagian: dasar atau batas yang mewakili pemodifikasi tersebut; bagian umum dari prisma dengan basis kongruen dan permukaan atas; potongan prisma atas yang tidak teratur (frustum). Panjang tepi Prisma yang (Sa, Sb, Sc) berhubungan dengan kekuatan pelarut pelarut secara berurutan (A. B dan C). Karena pelarut yang berbeda biasanya memiliki kekuatan pelarut yang berbeda, panjang tepi prisma umumnya tidak sama dan bidang atas prima tidak paralel dengan dasarnya. Jika prisma dipotong sejajar dengan dasar pada ketinggian dari tepi terendah (ditentukan berdasarkan kekuatan pelarut dari pelarut terlemah, pelarut C pada Gambar 7.14), bagian bawah memberikan prisma teratur, di mana bagian atas dan dataran adalah segitiga sama sisi paralel. Frustum atas model digunakan untuk optimasi fase gerak senyawa polar dalam fase normal kromatografi, sedangkan bagian teratur digunakan untuk pemisahan zat nonpolar dan cukup polar. Untuk kromatografi fase terbalik. bagian teratur dari prisma digunakan untuk mengoptimalkan pemisahan zat polar dan nonpolar.

Untuk senyawa polar optimasi selalu dimulai dari puncak segitiga tidak teratur dari model, baik dalam segitiga, ketika tiga pelarut dipilih, atau sepanjang sisi, ketika dua pelarut dipilih. Dalam segitiga yang ditunjukkan pada Gambar 7.14. komposisi pelarut tertentu (P) dapat dicirikan oleh volume fraksi yang sesuai dengan garis X, dalam kasus ini ditampilkan pada P, ini sesuai dengan 30% pelarut A. 20% pelarut B, dan 50% pelarut C, yang dapat dijelaskan oleh tiga digit nomor 325. P adalah titik selektivitas, dan semua komposisi pelarut pada permukaan segitiga dapat digambarkan melalui tiga-titik koordinat selektivitas. Optimasi dimulai dengan memilih kombinasi pelarut yang sesuai dengan titik pusat P₀ = 333 dan tiga poin lainnya berdekatan dengan puncak dari segitiga P¹ = 811, 181 dan 118. Jika pemisahan yang diperoleh tidak memadai, selektivitas poin lainnya diuji disekitar kombinasi pelarut yang memberikan pemisahan terbaik. Ketika mengubah poin selektivitas pada puncak segitiga, kekuatan pelarut juga berubah, terutama ketika kekuatan pelarut dari pelarut yang digunakan, digunakan untuk membentuk prisma yang berbeda. Kekuatan pelarut harus  disesuaikan dengan pelarut penyesuai kekuatan untuk menjaga pemisahan berada pada rentang nilai optimal R₁. Juga mungkin disarankan untuk mengubah poin selektivitas dengan penambahan kecil jika ukuran kecil bisa menyebabkan perubahan besar dalam resolusi.

Bagian tengah prisma digunakan untuk optimasi komposisi fase gerak untuk pemisahan sampel nonpolar dan cukup polar. Komposisi pelarut awal sesuai dengan pusat permukaan atas segitiga prisma; Komposisi ini kemudian diencerkan agar membawa semua komponen sampel ke dalam rentang nilai R₁, 0,2-0,8. Pada kekuatan pelarut ini tiga kromatogram lain dijalankan sesuai dengan poin selektivitas yang berdekatan dengan puncak segitiga. Percobaan awal ini kemudian digunakan untuk memilih poin selektivitas untuk kromatogram lebih lanjut sampai komposisi pelarut terbaik ditemukan. Kegagalan mendapatkan awal pemisahan mengharuskan permbentukan prisma baru, menggunakan pelarut yang berbeda setidaknya satu dari sisi segitiga.

Optimasi kekuatan pelarut dengan memvariasikan poin selektivitas harus dilakukan sampai setidaknya pemisahan awal diperoleh. Pada titik ini bagian ketiga dari model PRISMA dapat digunakan untuk memilih mode pengembangan yang tepat. Jika peningkatan efisiensi diperlukan untuk meningkatkan resolusi keseluruhan sampel kemudian pengembangan aliran yang dipaksa harus digunakan. Jika masalah pemisahan terjadi diatas rentang nilai R1 kemudian pengembangan anti-lingkaran mungkin merupakan pilihan terbaik, jika berada dalam rentang nilai dibawah R4, kemudian pengembangan lingkaran lebih dipilih. Jika pada titik ini pemisahan masih tidak memadai maka fase diam baru atau pelarut tambahan harus dipilih dan model PRISMA dimanfaatkan lagi untuk mengoptimalkan sistem baru. Nyiredy dkk (171) telah merangkum prosedur diatas dalam bentuk diagram alir yang berguna untuk panduan menerapkan semua langkah-langkah model.