METODE SEDERHANA UNTUK PEWARNAAN PROTEIN DAN ELEKTROFORESIS GEL ASAM NUKLEAT

METODE SEDERHANA UNTUK PEWARNAAN PROTEIN DAN  ELEKTROFORESIS GEL ASAM NUKLEAT

A.    Pendahuluan

Elektroforesis gel adalah metode yang kuat untuk analisis DNA, RNA, dan protein sampel. Elektroforesis gel merupakan suatu teknik analisis penting dan sangat sering dipakai dalam bidang biokimia dan biologi molekular. Secara prinsip, teknik ini mirip dengan kromatografi: memisahkan campuran bahan-bahan berdasarkan perbedaan sifatnya. Dalam elektroforesis gel, pemisahan dilakukan terhadap campuran bahan dengan muatan listrik yang berbeda-beda (menggunakan prinsip dalam elektroforesis).

Salah satu kelemahan beberapa teknik ini adalah bahwa teknik ini memakan waktu. Memang, upaya signifikan telah dilakukan untuk mengembangkan metode yang lebih cepat seperti CE dan sistem " chip pada sebuah laboratorium". Sementara metode tersebut menjanjikan, mayoritas peneliti tetap terus menggunakan teknik klasik, yang lebih disukai karena familier, handal, dan biaya rendah.

Dalam elektroforesis gel terdapat dua material dasar yang disebut fase diam dan fase bergerak (eluen). Fase diam berfungsi "menyaring" objek yang akan dipisah, sementara fase bergerak berfungsi membawa objek yang akan dipisah. Sering kali ditambahkan larutan penyangga pada fase bergerak untuk menjaga kestabilan objek elektroforesis gel. Elektroda positif dan negatif diletakkan pada masing-masing ujung aparat elektroforesis gel.

Zat yang akan dielektroforesis dimuat pada kolom-kolom (disebut well atau "sumur") pada sisi elektrode negatif. Apabila aliran listrik diberikan, terjadi aliran elektron dan zat objek akan bergerak dari elektrode negatif ke arah sisi elektrode positif. Kecepatan pergerakan ini berbeda-beda, tergantung dari muatan dan berat molekul DNA. Kisi-kisi gel berfungsi sebagai pemisah. Objek yang berberat molekul lebih besar akan lebih lambat berpindah.

Untuk melihat hasil pemisahan protein menggunakan elektroforesis, dapat dilakukan pewarnaan gel. Di dalam satu gel, bisa terdapat ribuan titik protein yang dapat dianalisis atau diambil (dipisahkan) menggunakan perangkat lunak tertentu.

Pewarnaan gel melibatkan proses manual yang memakan waktu. Seorang peneliti berulang kali mengulang untuk mengubah larutan. Situasi menjadi berat ketika seseorang ingin memproses beberapa jenis gel yang berbeda secara paralel dengan waktu awal yang berbeda. Protokol standar biasanya diberikan dalam buku-buku referensi seperti "Kloning Molekuler: Manual Laboratorium" dan "Protokol pada Biologi Molekuler". Pewarnaan Etidium bromida dari DNA dalam gel agarosa biasanya melibatkan penghapusan gel dari ruang elektroforesis, inkubasi dalam larutan pewarnaan selama 20 menit dan kemudian dalam air selama 30-60 menit, perubahan beberapa larutan seringkali dianjurkan untuk mencapai sensitivitas tertinggi. Pewarnaan gel DNA yang efektif dengan menggunakan biru metilen, lebih disukai karena toksisitas yang rendah dan kemampuannya untuk visualisasi tanpa sinar UV, umumnya membutuhkan pewarnaan menyeluruh untuk hasil yang baik.

Pewarnaan gel dapat dengan menggunakan coomasie atau pewarnaan perak. Gel protein poliakrilamida sering divisualisasikan dengan Coomassie biru atau pewarnaan perak. Pewarnaan perak, khususnya, melibatkan sejumlah langkah-langkah pengolahan yang membutuhkan waktu yang akurat. Protokol khusus yang bekerja dengan baik menurut pengalaman kami adalah inkubasi untuk memperbaiki larutan selama 15 menit, tiga kali dalam air selama 5 menit, dalam larutan sensitisasi selama 15 menit, kemudian dalam air lagi tiga kali selama 5 menit, dalam perak nitrat selama 30 menit, dalam larutan air dan pengembang selama 1 menit, pada pengembang selama, 10 menit, dan akhirnya penambahan larutan dihentikan.

Di sini kami menggambarkan sebuah sistem sederhana untuk mengotomatisasi protokol tersebut. Kami memprogram chip mikrokontroler untuk menjalankan pompa cairan miniatur untuk menambah dan menghapus larutan pada interval waktu tertentu. Sistem ini dibangun dari komponen-komponen murah. Sementara beberapa sistem komersial otomatisasi protokol gel pewarnaan tertentu yang ada (misalnya, dari Amersham dan BioRad), sistem ini, 50 kali lebih mahal dari yang dijelaskan di sini dan kurang fleksibel. Selain itu, kami menjelaskan sebuah metode baru dimana lempeng gel horisontal dapat secara otomatis bernoda dalam ruang elektroforesis setelah deteksi otomatis penurunan tegangan pada akhir elektroforesis.

B.     Bahan dan Metode

1.      Desain instrumen

Secara skematis, sistem kami diperlihatkan pada Gambar. 1. Model pompa digunakan karena biaya rendah (masing-masing $15) dan ketahanan kimia. Pompa disusun untuk mentransfer larutan antara botol reagen dan ruang pewarnaan melalui tabung silikon. Satu pompa digunakan sebagai sirkulator yang secara berkala mengalirkan larutan  pada gel untuk memastikan pencampuran yang efisien. Untuk gel yang lebih besar, kami menemukan bahwa hasil terbaik diperoleh dengan menggunakan dua sirkulator dan mengatur pipa untuk menyemprotkan larutan pada seluruh lebar gel. Juga berguna untuk menyisipkan gel diantara dua lapisan untuk mencegah gel melipat saat proses pewarnaan dan destaining. Kami mencatat bahwa metode ini menghilangkan kebutuhan agitasi, yang biasanya biayanya 10 kali sistem kami. Kami memprogram chip mikrokontroler yang murah (PIC 16F628A, biaya: $ 2) untuk mengaktifkan pompa dan mematikannya pada interval waktu tertentu. Mikrokontroler dipasang pada papan sirkuit murah yang ada tombol relay dan layar untuk pemrograman. Program ditulis dalam Dasar dan dikompilasi ke dalam kode mesin.

2.      Reagen dan peralatan elektroforesis

Agarosa, bufer Tris-asetat-EDTA (TAE), bufer Tris-glisin-SDS (TGS), etidium bromida, metanol, asam asetat, Brilliant R-250 biru, nitrat perak, formaldehid, asam sitrat, dan natrium tiosulfat dibeli dari Fisher Scientific. Metilen biru dan natrium karbonat dibeli dari Sigma. Penanda DNA λ HindIII dibeli dari Promega. Penanda noda protein dibeli dari Fermentas.

Lempeng gel agarosa (769 cm²) dioperasikan dalam sistem mini-gel horisontal (Fisher Scientific # FB-SB-710). mini-gel SDS-PAGE (1067 cm²) dibeli dari BioRad dan beroperasio dalam sistem mini-gel vertikal (sistem Mini Protean III BioRad). Gel yang lebih besar SDS-PAGE 16616 cm dibeli dari BioRad dan dioperasikan dalam sistem vertikal (BioRad Protean II system). Pewarnaan mini-gel protein dilakukan dalam tutup kotak ujung pipet (13.611,5 cm², diisi dengan, 150 mL larutan) (Fisher Scientific # 02-707-325), gel PAGE yang lebih besar dalam wadah tupperware (19.632 cm², diisi dengan, 600 mL larutan), dan pewarnaan gel DNA dilakukan dalam ruang elektroforesis (Fisher Scientific # FB-SB-710, diisi, 300 mL larutan). Gel bernoda-Etidium divisualisasikan pada gel Transilluminator UV dan metilen biru dengan pelat konverter putih dan foto diambil dengan kamera digital Nikon Coolpix 995. Gel SDS-PAGE divisualisasikan dengan scanner Canon CanoScan 3000ex.

C.    Hasil

1.      Gel asam nukleat

Untuk menunjukkan bahwa sistem kami dapat mewarnai mini-gel DNA agarosa, kami menggunakan pewarnaan etidium bromida dan metilen biru. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 2, sistem kami memberikan hasil yang sebanding dengan yang diperoleh saat pewarnaan gel secara manual. Gel ditunjukkan pada Gambar. 2 diproses dengan cara ini. Dalam metode ini, gel ditaruh dalam ruang elektroforesis horisontal, dan pewarnaan dan destaining larutan dilakukan di atas permukaan atas gel untuk memfasilitasi pewarnaan. Pendekatan ini memungkinkan pengguna untuk mulai elektroforesis dan mengulanginya. Jika diinginkan, kita juga dapat menggunakan nampan pewarnaan terpisah.

Gambar 2. Perbandingan antara pewarnaan mini-gel DNA agarose secara manual dan otomatis. (A) Ethidium bromida, dengan 250, 130, 60, dan 30 ng dari penanda HindIII. (B) Metilen biru, dengan 1500, 750, 400, dan 200 ng penanda HindIII l.

2.      Gel Protein

Kami menerapkan standar pewarnaan Coomassie biru dan perak untuk mini-gel SDS-PAGE. Foto-foto yang gel diproses ditunjukkan pada Gambar. 3 dan menunjukkan hasil yang baik. Seperti dibahas di atas, pewarnaan perak melibatkan banyak tahap dan terutama menunjukkan keuntungan sistem otomatis. Tujuh pompa diprogram secara otomatis agar menghantar, bersirkulasi, dan menguras, membilas, kepekaan, nitrat perak, mengembangkan, dan menghentikan larutan.

Gambar 3. Perbandingan pewarnaan mini-gel protein SDS-PAGE secara manual dan otomatis. Hasil dengan bentuk gel SDSPAGE yang lebih besar serupa. (A) Coomassie biru, dengan 360, 180, 90, dan 45 ng penanda protein. (B) Pewarnaan Silver dengan 60, 30, 15, dan 7,5 ng penanda protein.

D.    Pembahasan

Kami telah menunjukkan sebuah sistem yang sederhana dan murah untuk pewarnaan elektroforesis gel asam nukleat dan protein, sehingga mengotomatisasi tugas yang memakan waktu yang sering dilakukan secara manual oleh para peneliti dalam biologi molekuler. Sistem memberikan hasil sebaik yang dicapai secara manual. Program dapat dengan mudah dimodifikasi untuk menerapkan protokol lainnya. Sistem ini sangat murah juga praktis untuk beberapa pemrosesan gel yang banyak dengan protokol yang berbeda secara paralel.